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脂肪酶具有油-水界面的親和力，能在油-水界面上高速率的催化水解不溶于水的脂類物質；脂肪酶作用在體系的親水-疏水界面層，這也是區別于酯酶的一個特征。

來源不同的脂肪酶，在氨基酸序列上可能存在較大差異，但其三級結構卻非常相似。脂肪酶的活性部位殘基由絲氨酸、天冬氨酸、組氨酸組成，屬于絲氨酸蛋白酶類。脂肪酶的催化部位埋在分子中，表面被相對疏水的氨基酸殘基形成的螺旋蓋狀結構覆蓋（又稱“蓋子”），對三聯體催化部位起。“蓋子”中的α-螺旋的雙親性會影響脂肪酶與底物在油-水界面的結合能力，其雙親性減弱將導致脂肪酶活性的降低。“蓋子”的外表面相對親水，而面向內部的內表面則相對疏水。由于脂肪酶與油-水界面的締合作用，導致“蓋子”張開，活性部位暴露，使底物與脂肪酶結合能力增強，底物較容易地進入疏水性的通道而與活性部位結合生成酶-底物復合物。界面活化現象可提高催化部位附近的疏水性，導致α-螺旋再定向，從而暴露出催化部位；界面的存在還可以使酶形成不完全的水化層，這有利于疏水性底物的脂肪族側鏈折疊到酶分子表面，使酶催化易于進行。